旋渦混合器對脂肽化合物的分離純化的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）產(chǎn)生多種抗 菌次生代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是具有潛在的、能有效抑 制病原菌并促進(jìn)動(dòng)植物生長的有益菌 ，具有很 高的農(nóng)用及醫(yī)用價(jià)值 。近年來，隨著我國畜牧 養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，抗生素飼料添加劑造成的負(fù)面 影響嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)的健康發(fā)展?？咕淖?為一種新型抗生素的替代品具有諸多優(yōu)點(diǎn)，研發(fā) 和推廣綠色、安全、健康、可持續(xù)養(yǎng)殖發(fā)展的抗生 素替代品已成為研究方向。

LB培養(yǎng)基、Landy培養(yǎng)基 、PDA培養(yǎng)基為 國產(chǎn)分析純。

試驗(yàn)菌：4株枯草芽孢桿菌分別是GD株、SF-1 株、WT株和POC-4株，均分離自不同畜禽養(yǎng)殖場 周邊環(huán)境土壤，由大連三儀生物工程研究所保存。 指示菌：致病性大腸桿菌 O2、金黃色葡萄球 菌（ATCC25923）、啤酒酵母菌（ATCC9763）、雞白 痢沙門菌（CVCC2218）和桔青霉（AS3.2788）等標(biāo) 準(zhǔn)菌株，由中國微生物菌株保藏中心提供。

生物安全柜（Hfsafe-1800，上海力升科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9022，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；空氣浴振蕩培養(yǎng)箱 （HZQ-F160、HZQ-C，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開 發(fā)有限公司）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（TGL-20M， 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；旋渦混合器 （QL-866，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公 司）；凝膠成像系統(tǒng)（UVPGDS-8000，美國 UVP 公司）；高效液相儀（DIONEX U3000，美國DION? EX公司）；液質(zhì)（LC-MS）聯(lián)用儀Agilent 6540（QTOF LC/MS，美國安捷倫公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干 燥箱（DGG-9240A，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公 司）；電子天平（BS210S，北京賽多利斯有限公 司）；精密 PH 計(jì)（PHS-3C，上海虹益儀器有限公 司）；顯微鏡（XSZ-4G，重慶光電儀器有限公司）； 雙槽玻璃層析缸（薄層色譜展開槽/展開缸）（P1- 2020，上海楚定分析儀器有限公司）；全自動(dòng)立式 電熱壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-S2，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

表面活性素（surfactin）（標(biāo)準(zhǔn)樣品，美國Sigma 公司）；大孔樹脂（XAD-16，上海寶曼生物科技有 限公司）；硅膠板（Silica Gel GF254 20 cm×5 cm， 上?？婆d生物科技有限公司）；5%茚三酮溶液（乙 酸∶正丁醇=5∶95），乙酸、正丁醇、甲醇、無水乙 醇、鹽酸、茚三酮等試劑（分析純或色譜純，國產(chǎn)）。

將各指示菌分別采用相應(yīng)的固體平板培養(yǎng)基 進(jìn)行復(fù)蘇，37 ℃培養(yǎng)20 h（其中真菌采用28 ℃培 養(yǎng)36 h），再接種于裝有50 mL LB培養(yǎng)液的250 mL 三角瓶，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)20 h（其中真菌采用 28 ℃培養(yǎng)36 h），取出并通過平板計(jì)數(shù)法分別測定 指示菌數(shù)，并稀釋至1×106 cfu/mL，4 ℃保存、備用。

將4株分離株枯草芽孢桿菌分別在LB平板上 活化，37 ℃培養(yǎng)20 h，分別取活化的單菌落轉(zhuǎn)接于 裝有50 mL LB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，置37 ℃， 180 r/min，培養(yǎng)20 h。分別將各枯草芽孢桿菌再轉(zhuǎn) 種到裝有500 mL Landy培養(yǎng)液的3 000 mL三角瓶 中，接種量為5%，置32 ℃，180 r/min培養(yǎng)，備用。

取各分離株枯草芽孢桿菌24 h發(fā)酵液進(jìn)行處 理，采用管碟法 ，對致病性大腸桿菌、沙門菌，金 黃色葡萄球菌、啤酒酵母菌、青霉素等指示菌分別 抑菌效果檢測，設(shè) 3 個(gè)重復(fù)，1 個(gè)培養(yǎng)基陰性對 照，1個(gè)陽性對照（革蘭氏陽性菌采用桿菌肽鋅、 革蘭氏陰性菌采用硫酸黏桿菌素、真菌采用兩性 霉素，配置濃度參照中國藥典規(guī)定配制），觀測各 芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的抑菌譜。

結(jié)果顯示，不同分離株的枯草芽孢桿菌產(chǎn)生 的抑菌圈不同，同一分離株枯草芽孢桿菌對不同 指示菌的抑菌圈大小也不同；從抑菌圈來看，對真菌效果較好（20 mm左右），對革蘭氏陽性葡萄球 菌抑菌效果明顯（≥ 20 mm），好于革蘭氏陰性菌抑 菌效果（D≈ 15~20 mm之間），其中分離株（GD）抑 菌圈達(dá)到20 mm，好于對照組。初步確 定GD株作為后續(xù)研究菌株。結(jié)果顯示：硅膠板經(jīng)過層析后，直接噴灑茚三 酮染色劑后加熱，樣品及標(biāo)品表面活性素在相應(yīng) 部位均沒有顯示，說明樣品和標(biāo)品中均沒有游離 氨基酸存在，分子結(jié)構(gòu)均為環(huán)狀結(jié)構(gòu)；采用濃HCl 進(jìn)行原位水解后，在相應(yīng)部位能見到標(biāo)品及樣品 的痕跡，再用茚三酮染色后，在對應(yīng)位置處樣品和 標(biāo)品均能顯色，說明樣品和標(biāo)品中已有游離氨基 酸存在，環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)均已經(jīng)打開。薄層板上樣品與標(biāo)品兩個(gè)顯色斑點(diǎn)所處的位置 比較表明，它們遷移的速度一致。初步判斷該GD 株產(chǎn)生的抗菌產(chǎn)物與標(biāo)品屬于同一類脂肽化合物， 即表面活性素（urfactin）或表面活性素的同系物。

不同的芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對不同指 示菌有不同的抑菌效果，對同種指示菌也有不 同的抑菌活性；同種芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對不同指示菌有也有完全不同的抑菌效果。根據(jù)研 究資料顯示，枯草芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌 （B. amyloliquefaciens） 、短小芽孢桿菌（B. pum? ilus） 、地衣芽孢桿菌（B. lichemformis） 、蠟樣芽 孢桿菌（B. cereus）、蘇蕓金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis） 、類芽孢桿菌（Paenibacillus）和 環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulan）等均能產(chǎn)生抗 菌物質(zhì)，產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)是否類似、以哪一種為主 要組分，有待于進(jìn)一步研究。

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