細(xì)菌計(jì)數(shù)器對(duì)聚多巴胺涂層的抗污染性能研究的

生物粘附是一種常見的材料表面的生物污染 現(xiàn)象，是一種界面行為，通常是指污染物( 如蛋 白、細(xì)菌、真菌等) 在材料表面吸附/粘附的現(xiàn)象， 廣泛地存在于自然界和人們的生活中。蛋白質(zhì)、 細(xì)菌等生物分子在材料表面的附著和聚集，會(huì)對(duì) 材料表面造成污染，影響材料與器件及設(shè)備的使 用性能。例如，蛋白質(zhì)經(jīng)常在植入式生物器 件表面發(fā)生非特異性粘附，造成檢測(cè)失準(zhǔn)、性能降低。

多巴胺、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、BCA 試劑盒購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。酵母粉、 蛋白胨、瓊脂購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。 細(xì)胞培養(yǎng)液、SYTO9/PI 購(gòu)自西格瑪試劑公司。 恒溫培養(yǎng)箱( LＲH-70，上海一恒科學(xué)儀器有 限公司) ; 滅菌鍋( YX-280D，江陰濱江醫(yī)療器械設(shè) 備有限公司) ; 超凈工作臺(tái)( SW-CJ-1FD I 類 B 型， 蘇靜安泰潔凈工作臺(tái)) ; 離心機(jī)( Micro Centrifuge 220vAc) ; 搖床( HZ-9211K 恒溫振蕩器，太倉(cāng)市科 教器材廠) ; 細(xì)菌計(jì)數(shù)器( Shineso 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司) 和酶標(biāo)儀。

將 1cm×2. 5cm 的空白基底浸入使用 tris 緩 沖溶液( pH 8. 5) 新鮮配制的 2mg /mL 多巴胺溶 液，分別進(jìn)行靜置過夜生長(zhǎng)聚多巴胺薄膜和在搖 床中以 300r /min 振蕩過夜生長(zhǎng)聚多巴胺薄膜。然后，將空白基底、靜置生長(zhǎng)的聚多巴胺薄膜和振 蕩生長(zhǎng)的聚多巴胺薄膜分別與 2mL 1. 7g /L 的牛 血清蛋白( BSA) 的磷酸緩沖溶液在 37℃ 下共培 養(yǎng) 4h，取出并分別放入 2mL 的磷酸緩沖溶液中超 聲洗滌 15s。使用酶標(biāo)儀在 562nm 下測(cè)量樣品的 吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出每個(gè)孔中的吸光值， 計(jì)算每種材料的單位面積上蛋白的吸附量。

活化金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。然后，分 別取出 2mL，離心，棄其上清液，加入磷酸緩沖溶 液至 2mL，振 蕩 均 勻。用紫外分光光度計(jì)在 600nm 測(cè)試菌懸液吸光度。當(dāng)吸光度值置于 0. 2 ～ 0. 8 之間時(shí)，為有效; 否則，繼續(xù)用磷酸緩沖溶 液調(diào)整，使其吸光度值至 0. 2 ～ 0. 8 區(qū)間。用有效 的菌懸液作為為初始菌懸液，用磷酸緩沖溶液進(jìn) 行梯度稀釋，稀釋 8 次，選最后 3 組菌濃度分別為 107 、106 和 105 CFU /mL 的菌懸液進(jìn)行抗粘附測(cè) 試。以振蕩生長(zhǎng)的聚多巴胺為實(shí)驗(yàn)組，以靜置生 長(zhǎng)的聚多巴胺薄膜涂層和空白基底作為對(duì)照組實(shí) 驗(yàn)。在無(wú)菌條件下每種材料分別放入六孔板中， 然后在每孔放入 2mL 不同濃度的菌懸液中，放在 恒溫培養(yǎng)箱溫存 24h。然后，分別將材料取出，用 磷酸緩沖溶液輕輕沖洗。再用 SYTO9 /PI 對(duì)材料 表面進(jìn)行避光染色 15min。之后，用磷酸緩沖溶 液輕輕沖洗材料，再在 20 倍共聚焦顯微鏡下觀察 細(xì)菌吸附在材料表面的情況。用 Image-J 軟件處 理圖像，計(jì)算出單位面積材料上細(xì)菌吸附量。

將不同基底材料( 玻璃、不銹鋼和塑料片) 放 入新鮮配置的多巴胺溶液，然后，分別進(jìn)行靜置和 振蕩處理 24h。然后，取出，觀察發(fā)現(xiàn)在靜置處理 的樣品組中，所有的樣品表面均形成了一層均勻 的淡黃色薄膜; 在振蕩處理的樣品組中，所有的樣 品表面均形成了一層不均勻的黑色薄膜，如圖 1 所示。這些結(jié)果表明，聚多巴胺涂層可以在多種 基底材料表面生成，而且，振蕩方法生成的聚多巴 胺涂層表現(xiàn)出與黑色素類似的本體顏色，說(shuō)明振 蕩方法生成的聚多巴胺涂層較厚。這應(yīng)該與振蕩 過程加快了多巴胺的自聚合反應(yīng)速度相關(guān)。 有趣的是，據(jù)報(bào)道靜置溶液方法生成的聚多 巴胺涂層通常具有約 60°的靜止接觸角。我們 在靜置生成的聚多巴胺涂層表明也測(cè)量到 55°的靜止接觸角。然而，振蕩生成的 聚多巴胺涂層的接觸角低于 15°，表明該振蕩生 成的聚多巴胺涂層具有超親水性。這有望賦予該 聚多巴胺涂層良好的抗生物吸附性能。材料表面是否能夠抵抗蛋白質(zhì)吸附是材料表 面是否抗生物污染的關(guān)鍵因素之一。由于 BSA 在通常的培養(yǎng)基中的含量比較高，所以本實(shí)驗(yàn)使 用 BSA 來(lái)研究蛋白吸附，并使用 BCA 試劑盒來(lái) 研究 BSA 在空白基底、靜置生長(zhǎng)的聚多巴胺薄膜 和振蕩生長(zhǎng)的聚多巴胺薄膜上的吸附情況?？梢钥闯?，振蕩生長(zhǎng)的聚多巴胺薄膜上蛋 白吸附量明顯低于空白基底和靜置生長(zhǎng)的聚多巴 胺薄膜上蛋白吸附量，說(shuō)明振蕩生長(zhǎng)的聚多巴胺 薄膜能夠有效地降低蛋白吸附。

研究表明，振蕩生長(zhǎng)的聚多巴胺薄膜顏色更 深、成膜較厚，并表現(xiàn)出超親水性，從而對(duì) BSA 和 革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性的大 腸桿菌均表現(xiàn)出良好的抗吸附性能。這種振蕩方 法制備的超親水性的聚多巴胺薄膜可以作為一種 綠色的、生物兼容的抗污染涂層材料，在生物醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。





 

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