用TS-8對人肝星狀細(xì)胞HSC-LX2增殖分析

1 材料 

1.1 儀器 

2001HY-6003 型 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、902 型－80 ℃冰 箱（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；全波段多功能 酶標(biāo)儀、Universal HoodⅡ型成像分析儀（美國 Bio-Tek 公司）；PHS-25型數(shù)顯臺式pH計（上海越平科學(xué)儀器有 限公司）；CP124C 型電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限 公司]；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機（美國Eppendorf公司）；BD FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公 司）；TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有 限公司）；Promo Vert型倒置顯微鏡[成貫儀器（上海）有 限公司]；SW-CJ-2D 型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限 公司）；LDZX-50FBS型滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）； DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；ZHWY-103D型恒 溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；K30 型干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）；Step One PlusTM型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國 Applied Biosystems公司）；XH-B型旋渦混合器（江蘇康 健醫(yī)療用品有限公司）。 

1.2 藥品與試劑 

原阿片堿由廖尚高教授課題組提供，高效液相色譜 法（HPLC）和核磁共振檢測純度均在95％以上；磷酸鹽 緩沖液（PBS粉末，無錫傲銳東源生物科技有限公司，自 配，pH 7.2～7.4，質(zhì)量濃度：11.74 μg/mL）；RPMI-1640培 養(yǎng)基、0.25％胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號：8117293、 1967534）；胎牛血清（美國ScienCell公司，批號：23954）。

2 方法 

2.1 原阿片堿溶液的制備 

用 DMSO 溶解原阿片堿，制成濃度為 100 mmol/L 的母溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），0.22 μm的微孔濾膜濾過除菌。 

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 

HSC-LX2細(xì)胞使用含有10％胎牛血清及100 u/mL 青霉素和100 μg /mL鏈霉素的1640高糖培養(yǎng)基于37 ℃、 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換一次液，待細(xì)胞融合至 80％～90％時傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗。 

2.3 MTT法檢測HSC-LX2細(xì)胞的增殖抑制率 

取對數(shù)生長期的HSC-LX2細(xì)胞，以0.2 ％胰蛋白酶 消化，以離心半徑 4 cm（下同）、1 000 r/min 離心 5 min， 收集細(xì)胞，用含10％胎牛血清1640培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，以 5×104 mL－1 的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，邊緣用 200 μL 無菌的 PBS 填充以防干燥，置于 37 ℃、5％ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置貼壁。再將HSC-LX2 細(xì)胞隨機分為對照組、DMSO組和不同濃度的原阿片堿 組（25、50、100、200、400、500 μmol/L），每組 6 個復(fù)孔。輕輕吸棄原培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，對照組加入含5％胎牛 血清1640培養(yǎng)基100 μL，DMSO組加入含5‰DMSO的 1640 培養(yǎng)基 100 μL，原阿片堿組分別加入 25、50、100、 200、400、500 μmol/L原阿片堿的含5％胎牛血清1640培 養(yǎng)基100 μL?！?/p>

3 結(jié)果 

3.1 細(xì)胞增殖抑制率 

與對照組比較，DMSO組細(xì)胞的OD值無明顯變化 （P＞0.05），50、100、200、400、500 μmol/L 原阿片堿組細(xì) 胞的OD值均明顯減小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。隨著原阿片堿濃度的增加，細(xì)胞的OD值 逐漸減小。

3.2 細(xì)胞凋亡率 

與對照組比較，中、高濃度原阿片堿組細(xì)胞凋亡率 顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

4 討論 

肝纖維化是一種慢性、進(jìn)行性、彌漫性的肝病理生 理現(xiàn)象，屬可逆病變。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，盡管不同病 因?qū)е赂卫w維化的機制不同，但均具有一個共同點，即 都有HSCs的參與，HSCs是纖維化反應(yīng)的重要效應(yīng)器和 細(xì)胞因子的主要來源和靶點 。

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