白酒酒曲真菌群落結構的分析(GL-88B使用)

在我國常采用大曲、小曲和麩曲生產白酒，固態(tài)發(fā)酵 生產白酒方法中，大曲既是一種粗制酶制劑，又是一種糖 化發(fā)酵劑，同時也起生香作用。由于大曲是自然培養(yǎng)而 成的，所以含有霉菌、酵母、細菌等多種微生物種群及其產 生的蛋白酶酶系、淀粉酶酶系及風味酶酶系等復合酶系， 是一種多菌種的混合酶制劑，為形成復雜的香氣成分起 重要作用，由此可見，曲的優(yōu)劣與酒的質量和酒體風格直 接相關，名酒之所以為名酒，名在質量，貴在風格。微生物 在白酒釀造中起著主要作用，因此了解微生物在酒曲培養(yǎng)以及白酒釀造過程中的習性和作用，不僅有利于提高白酒 質量，而且可滿足消費者對于曲酒類型的不同需求以及對 曲酒品質的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒中高溫曲（1月齡、2月齡、4月齡，分別命名 為Z1、Z2、Z3）、芝麻香型白酒高溫曲（命名為AA1）：均取 自河南省宋河酒業(yè)股份有限公司。樣品采集后迅速粉碎密 封，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?br />
1.1.2 主要試劑

Taq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合 酶（5 U/μL）：美國Thermo公司；E.Z.N.A.Soil DNA提取試 劑盒：美國OMEGA公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒： 生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 DNA檢測試 劑盒：美國Life公司。

1.2 儀器與設備

Mastercycler PCR儀：德國Eppendorf公司；Pico-21臺式 離心機：美國Thermo Fisher公司；其林貝爾GL-88B漩渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器： 拓能達科技有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠； GelDoc-ItTS3凝膠成像系統：美國UVP公司；Miseq高通量 測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

酒曲中微生物總DNA的提取按照DNA提取試劑盒說 明書中的方法和步驟進行。

1.3.2 聚合酶鏈式反應及測序

以總DNA為模板，采用Miseq測序平臺的通用引物 ITS1（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode） CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2-Rev（5'-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對酒曲中真菌的ITS序列進行 PCR擴增。PCR擴增體系：10×PCR buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三 磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）0.1 mmol/L， DNA 10 ng，ITS1 0.5 μmol/L，ITS2-Rev 0.5 μmol/L，Plantium Taq 0.05 U，用雙蒸水補充至50 μL。 PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃ 退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計5個循環(huán)；然后94 ℃變性20 s， 45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計20個循環(huán)；最后72 ℃延 伸5 min。 PCR擴增結束后，PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳，利用 SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR擴增產物。利用 Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的PCR擴增產物進行精確 定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 數據分析

將測序獲取的原始序列的雙末端序列融合成一個方 向的序列并進行質量控制（quality control，QC），方法如下：
（1）序列的融合，采用1.2.3 Flash軟件融合雙末端的序 列，通過各個樣品的barcode使數據回歸樣品，并對各個樣 品序列進行質量控制。
（2）QC分析：采用V0.20.4 Prinseq軟件對序列閱讀框的 3'端進行質控，去掉堿基質量（Q）值＜20的數據，提高后續(xù) 序列的融合比率；通過Flash軟件融合雙末端序列，使其形 成一條序列；采用Prinseq軟件去除各個樣品的引物序列、小 于200 bp的序列、低質量序列和低復雜度序列；截掉非靶區(qū) 域序列和嵌合體，首先采用1.30.1 Mothur軟件的Pre. cluster 模塊校正測序錯誤，校正過程中允許的最大錯配是1/150。 然后，以Silva數據庫中的序列作為模板，采用Uchime功能 模塊去掉嵌合體和非靶區(qū)域序列。

2 結果與分析

2.1 序列的拼接

采用Illumina Miseq測序平臺得到Z1、Z2、Z3、AA1樣 本對應的原始序列分別為49 404條、51 278條、64 658條和 98 202條，其平均長度分別為317.72 bp、304.71 bp、296.31 bp 和254.15 bp，經拼接、過濾，分別得到有效序列49 389條、 51 246條、64 587條和97 934條，其平均長度分別為273.91 bp、 261.13 bp 、252.28 bp和211.03 bp。

2.2 序列豐富度和多樣性分析

香農（Shannon）指數、ACE指數、Chaol指數、辛普森 （Simpson）指數和Coverage指數是常用于描述微生物群落 物種多樣性的Alpha多樣性指數，這5個多樣性指數可以對 群落物種組成的豐富度及群落物種組成的均勻度進行綜 合性的評價，5個多樣性指數中的Shannon指數對微生物群 落物種多樣性更為敏感。其中，Shannon指數越大，群落物 種的多樣性越高；Chaol指數或ACE指數越大表明群落物 種豐富度越高；由Coverage指數可知本次實驗的取樣是否 合理，若Coverage指數＞97%，則證明本次取樣是合理的；但Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低?；诟咄?量測序技術對濃香型白酒中高溫曲和芝麻香型白酒高溫 曲中真菌的序列數量、操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）和Alpha多樣性指數進行研究，結果見表1。

對數值上略有差異，但都可以看出測序數據量已足 夠大，可以反映樣本中絕大多數的微生物信息。通過對4個 樣本對比分析可知，在濃香型白酒中高溫曲中，樣品Z3的 Chao1指數值（668.43）最大，說明Z3樣本的真菌群落物種豐 富度最高；樣品Z2的Shannon指數值（1.42）最大且Simpson 指數值（0.36）最小，說明樣品Z2的真菌群落多樣性最高。 芝麻香型白酒高溫曲樣本AA1的Chao1指數值（764.45）和 Shannon指數值（2.65）都比濃香型白酒中高溫曲的指數值 大，因此，芝麻香型高溫曲的真菌物種豐富度和真菌群落 多樣性都比濃香型白酒中高溫曲的大。4個樣品的Coverage 指數都＞97%，說明本次取樣是合理的，測序結果能反映 樣本的真實情況。

2.3 香農指數曲線分析

香農指數曲線反映樣品中微生物多樣性，可以用于比 較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用于說 明樣本的測序數據量是否合理。當曲線趨向平坦時，說明 測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU， 反之則表明繼續(xù)測序還可能產生較多新的OTU。

3 結論

本實驗基于Illumina MiSeq高通量測序研究了宋河酒 業(yè)濃香型白酒中高溫酒曲和芝麻香型白酒高溫酒曲中的 真菌群落結構。在屬的分類水平上分析，濃香型白酒中高 溫酒曲的優(yōu)勢真菌群（相對豐度≥1%）主要有假絲酵母 （Candida）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、根毛霉屬（Rhizomucor）等。芝麻香型白酒高溫酒曲的優(yōu)勢真菌群主要有 假絲酵母（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、威克漢姆酵母 （Wickerhamomyces）等。隨著濃香型白酒中高溫酒曲貯存 時間的延長，假絲酵母（Candida）的相對豐度逐漸增加，其 在兩種酒曲中都是優(yōu)勢真菌，此屬中有許多種具有酒精發(fā) 酵的能力。采用高通量測序技術對酒曲中的菌落物種分類 研究，操作簡單、通量高、信息豐富，和傳統方法比較具有 一定的優(yōu)越性。該研究成果為進一步研究優(yōu)化制曲工藝、 提高酒曲質量指明了方向，具有重要的理論和實踐意義。



 

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