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    脫色搖床使用-小細(xì)胞肺癌早期診斷的初步研究

    返回列表 來(lái)源:未知 發(fā)布日期:2019-11-03 10:06【

    非小細(xì) 胞 肺 癌(NSCLC)是最 常 見(jiàn) 的 惡 性 腫 瘤 之一,其發(fā)病率死亡率均位居惡性腫瘤第一位。 研究表明,可通過(guò)檢測(cè)肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì) 胞(CTC)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)進(jìn)行早期診斷。本研 究選取了一種基于微流控平臺(tái)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選 儀器,通過(guò)對(duì) 分 選 出 的 CTC 通過(guò)免疫化學(xué)染色計(jì)數(shù),與常規(guī)腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行對(duì)比,探討 CTC 檢測(cè)用 于 NSCLC早期診斷的可行性。

    1 材料和方法

    1.1 研究對(duì)象

    觀察對(duì)象為2017年01年至2019年01月期間 在深圳市人民 醫(yī) 院 確 診 為 NSCLC 的65例癌 癥 患者。入組標(biāo)準(zhǔn):年 齡18-80周歲,性 別 不 限;病 理 診 斷為 NSCLC患者,所有患者均接受肺部 CT 掃描, 腹部 B超,全身骨 ECT,頭顱 MRI及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢 查以明確分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;既往無(wú)腫瘤病史;入院前 未接受抗腫瘤的相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):臨床檢驗(yàn)判 定小細(xì)胞肺癌或其他惡性腫瘤;合并其他腫瘤患者。 本研究已經(jīng)過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者對(duì)研 究知情并簽署知情同意書。

    1.2 材料和儀器

    NCI-H1975(非小 細(xì) 胞 肺 癌 細(xì) 胞 系)購(gòu) 自 中 國(guó) 科學(xué)院細(xì) 胞 庫(kù),活細(xì)胞熒光染料 CelltrackerCMF- DA(貨 號(hào):C7025)、細(xì) 胞 核 染 料 Hoechst33342(貨號(hào):H1399)、磁力架(貨號(hào):A31543)購(gòu)自美國(guó) Ther- moFisher公司;低速大容量離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科 學(xué)儀器廠;垂直混合儀和微型水平脫色搖床購(gòu)自江蘇海門其林貝爾公司;微型臺(tái)式真空泵購(gòu)自上海斯 曼峰醫(yī)療器械公司;熒光顯微鏡及單細(xì)胞挑取系統(tǒng) 購(gòu)自 奧 林 巴 斯 (深 圳)工 業(yè) 有 限 公 司,ClearCell○R FX1循環(huán)腫瘤細(xì)胞活性分離系統(tǒng)購(gòu)自新加坡的 Clearbridge生物醫(yī)學(xué)公司,CTC鑒定染色過(guò)程的細(xì) 胞固定液、透化液、封閉液、抗體稀釋液、抗體混合液 (含偶聯(lián)過(guò) 氧 化 氫 酶 pan-CK-抗體 和 偶 聯(lián) 堿 性 磷 酸 酶 CD45)、酶顯色底物等配套試劑由深圳華大生命 科學(xué)研究院提供支持。 采用化學(xué)發(fā) 光 法 檢 測(cè) 腫 瘤 標(biāo) 記 物 NSE(貨號(hào): CPO11070)、CEA(貨號(hào):CPO11050)、Cyfra21-1(貨 號(hào):CPO11040)由深圳市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科采 用 上 海 透景生命科技股份有限公司相關(guān)試劑盒檢測(cè)。

    1.3 檢測(cè)方法

    1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    NCI-H1975細(xì)胞用含有10%熱 滅火胎牛血清100IU/ml青鏈霉素的1640培養(yǎng)基 培養(yǎng),培養(yǎng)的細(xì)胞用 DPBS 磷酸緩沖液洗滌2次后 用0.25%胰蛋白酶消化傳代或收獲細(xì)胞。

    1.3.2 細(xì)胞摻入與細(xì)胞回收率統(tǒng)計(jì)

    NCI-H1975 細(xì)胞培養(yǎng)至融合度約為80%后用胰酶進(jìn)行消化,加 入 CelltrackerCMFDA 染色工作液,于細(xì)胞正常生 長(zhǎng)條件下孵 育30 min。換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 30min,將細(xì)胞 用 PBS漂洗 后,在熒光顯微鏡下使 用單細(xì)胞挑取系統(tǒng)挑取準(zhǔn)確數(shù)量的細(xì)胞,按 照 5CTC/3 ml、25CTC/3 ml、50CTC/3 ml摻 入 全 血 中,每組設(shè)3個(gè)組內(nèi)平行。 分別按照CTC定量檢測(cè)試劑盒及ClearCell○R FX1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞活性分離系統(tǒng)說(shuō)明書進(jìn)行 CTC分離操 作,得到的細(xì)胞懸液置于96孔板中,在熒光顯微鏡下 進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。按以下公式進(jìn)行回收率計(jì)算:CTC回 收率=觀測(cè)CTC數(shù)量/摻入CTC總數(shù)×100%。

    1.3.3 CTC 的定量檢測(cè)

    每 位 受 試 者 采5ml血 液樣本,用 含 肝 素 鈉 的 BD Vacutainer管收 集 后 保 存于4℃冰箱,并且在采集后6h內(nèi)進(jìn)行處理。CTC 的定量檢測(cè)按照ClearCell○RFX1循環(huán)腫瘤細(xì)胞活性 分離系統(tǒng)說(shuō)明書進(jìn)行操作。CTC分離后,按照邁新 生物雙重免疫化學(xué)染色標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行染色鑒定,在 熒光顯微鏡明場(chǎng)下進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    使用 SPSS20.0軟件 進(jìn) 行 統(tǒng) 計(jì) 分 析,計(jì) 數(shù) 資 料 采用χ 2 檢驗(yàn)進(jìn) 行 分 析,以 P<0.05為差 異 有 統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    通過(guò) CTC 分離回收效率公式計(jì)算標(biāo)記并染色 的 NCI-H1975細(xì)胞回收效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,通過(guò) 循環(huán)腫瘤細(xì)胞滲入實(shí)驗(yàn),NCI-H1975細(xì)胞的回收率 為(83.3-86.3)%,平均值為(85.0±1.5)%(表1)。

    為確定經(jīng)免疫化學(xué)染色鑒定后的腫瘤細(xì)胞形態(tài) 特征,我們先 對(duì) NCI-H1975肺癌 細(xì) 胞 系、正 常 人 外 周血單核細(xì)胞 PBMC進(jìn)行了染色鑒定,染色后腫瘤 細(xì)胞呈現(xiàn)典型的紅色,PBMC 染色后呈現(xiàn)典型的藍(lán) 黑色,形態(tài)特征見(jiàn)下圖1。


    3 討論

    研究表明,循環(huán)腫瘤細(xì)胞與多種惡性腫瘤的臨 床病理分期及預(yù)后密切相關(guān),其在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā) 中的作用也日益受到關(guān)注。由于外周血循環(huán)腫瘤 細(xì)胞水平極低 ,這使得富集分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞挑戰(zhàn) 巨大。目前,包括基于細(xì)胞物理學(xué)特性的方法、基于 磁性親和選擇的分選方法和基于微流體的生物學(xué)的 分選方法在內(nèi),各種循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅 速,但大多處于研發(fā)階段,從技術(shù)平臺(tái)和臨床應(yīng)用角度仍有巨大發(fā)展空間。微流控技術(shù)是近些年在循環(huán) 腫瘤細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域新興的重要技術(shù)平臺(tái),其利用不 同方法的捕獲效率基本在70%以上。本研究選 取了一種具有高效、不依賴腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物特 點(diǎn)的基于微流控平臺(tái)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選儀器,其 原理是基于尺寸大小不同的細(xì)胞在微流控芯片中表 現(xiàn)出力學(xué)特征的不同,從而通過(guò)慣性遷移達(dá)到分離 的效果。

     


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